Métodos laboratoriais

Imunoglobulinas são proteínas produzidas pelo sistema imunológico que reconhecem substâncias estranhas ao organismo, se ligam a elas e as neutralizam. Imunoensaios são exames que se baseiam na ligação específica de imunoglobulinas (anticorpos) com a substância que elas reconhecem (antígeno). Imunoensaios podem ser usados para detectar e medir um anticorpo ou um antígeno no sangue e em outros líquidos.

Quando imunoensaios são usados para avaliar um anticorpo, o sistema de teste contém o antígeno correspondente, que reagirá com o anticorpo presente na amostra. Se não houver reação, a amostra não contém quantidades apreciáveis do anticorpo pesquisado. Exemplos de imunoensaios que pesquisam anticorpos incluem o fator reumatoide (procura anticorpos presentes em pessoas com artrite reumatoide) ou a pesquisa de anticorpos produzidos pelo corpo contra infecções (como a causada pelo vírus do oeste no Nilo) ou para avaliar o efeito de vacinas (como anticorpos contra o vírus da hepatite B).

Quando o imunoensaio é usado para avaliar antígenos na amostra, o sistema de exame contém anticorpos contra o antígeno pesquisado. A reação com o antígeno presente na amostra é comparada à reação de concentrações conhecidas de padrões, permitindo uma avaliação da quantidade de antígeno presente. Exemplos de imunoensaios que avaliam antígenos incluem dosagens de medicamentos (como digoxina e vancomicina), hormônios (como insulina, TSH e estrogênios) e marcadores tumorais, como antígeno prostático específico (PSA), CA-125 e alfa-fetoproteína.

Fontes
(© 2006). Immunoassay Detection Technologies, Chapter 2. Abbott Diagnostics Scientific Resources Learning Guide [On-line information]. PDF available for download through http://www.abbottdiagnostics.com.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W. Chapter 10, Immunoassays. Pp. 117-119.

Esse método é um tipo de imunoensaio. Anticorpos se ligam a antígenos formando complexos antígeno-anticorpo, que podem ser detectados e medidos por antígenos ou anticorpos ligados a uma enzima.

Para detectar um anticorpo no sangue de um paciente, o antígeno correspondente é ligado a uma superfície sólida. Se a amostra contém o anticorpo, ele se ligará ao antígeno. Um segundo anticorpo, contra imunoglobulinas humanas, marcado com uma enzima, é adicionado. Se anticorpos na amostra do paciente se ligaram ao antígeno ligado à fase sólida, eles serão indicados por uma reação provocada pela enzima.

Fontes
(© 1994-2006). Introduction to Antibodies – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Millipore Corporation [On-line information]. Available online at http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp through http://www.chemicon.com.

(2001). Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists [On-line information]. Available online at http://www.tiaft.org/tiaft2001/lectures/l13_gerostamoulos.doc through http://www.tiaft.org.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W.

Western blot é um tipo de imunoensaio que detecta proteínas específicas. É composto por uma eletroforese inicial, seguida de uma transferência (blot) das proteínas para uma membrana. É frequentemente utilizado como teste de acompanhamento para confirmar a presença de determinado anticorpo e auxilia no diagnóstico de algumas doenças.

Exemplos de testes que utilizam essa técnica são o exame confirmatório da infecção pelo virus HIV e da doença de Lyme. Nos dois casos, a membrana contém proteínas do agente causador separadas por eletroforese. O sangue do paciente, quando contém anticorpos, reage com essas proteínas, e a reação é detectada por um anticorpo contra imunoglobulina humana marcado com uma enzima. A reação é interpretada em comparação com padrões positivos e negativos.

Fontes
Khalsa, G. Western blotting. Arizona State University, School of Life Sciences, Mama Ji’s Molecular Kitchen [On-line information]. Available online at http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/western/western.html through http://lifesciences.asu.edu.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA and Ashwood ER, Bruns DE, eds. 4th edition St. Louis: Elsevier Saunders; 2006.

Esse método molecular usa sondas fluorescentes para observar genes ou sequências de DNA em cromossomos.

Seres humanos normalmente têm 23 pares de cromossomos: 22 pares independentes do sexo (autossomos) e um par de cromossomos sexuais (XX em mulheres e XY em homens). Os cromossomos contêm DNA (ácido desoxirribonucleico) e proteínas associadas. O DNA é uma sequência de quatro bases que se repetem formando milhares de genes que dirigem a produção de proteínas no corpo e determinam nossas características físicas. Contem duas cadeias complementares que formam uma hélice dupla, como uma escada em espiral.

No método FISH, uma amostra de células da pessoa é fixada em uma lâmina de vidro, incluindo células do sangue, da medula óssea, do líquido amniótico ou de tumores, dependendo da indicação do exame. As lâminas são, então, aquecidas para separar as duas cadeias do DNA das células. Sondas fluorescentes que contêm sequências de DNA complementares à que se deseja observar são adicionadas e se ligarão à sequência pretendida nas células. Quando as lâminas são examinadas em um microscópio de fluorescência, os genes correspondentes às sondas podem ser observados como manchas fluorescentes brilhantes contra um fundo escuro.

Esse método é usado para mostrar a presença de um excesso de cópias de um gene (genes duplicados ou amplificados) e sequências que estão em falta (deleções de genes) ou se moveram (translocação de genes). Um aumento do número de cromossomos, como na trissomia 21, ou síndrome de Down, também pode ser diagnosticado com esse método. Diversas sequências de DNA podem ser investigadas na mesma lâmina usando sondas com corantes fluorescentes de cores diferentes.

As fotografias abaixo mostram alguns exemplos de células examinadas com o método FISH.

Sindrome de Down
Na Figura 1, o método FISH é aplicado a células do líquido amniótico obtidas de uma mulher com um feto com suspeita de síndrome de Down (trissomia 21). Em vermelho, podem ser observadas três cópias do cromossomo 21 nas células do feto. O brilho verde mostra duas cópias do cromossomo 13, obtidas com uma sonda controle para verificar se o método está funcionando direito.

Câncer de mama
Na Figura 2, o método FISH é usado para pesquisar amplificação do gene HER-2/neu, em vermelho. Em cerca de 25% dos casos de câncer de mama, esse gene está amplificado, o que significa sensibilidade do tumor ao medicamento Herceptina, que visa a proteína codificada por esse gene. Não havendo amplificação, devem ser considerados outros tratamentos.

Leucemia 
A Figura 3 mostra o método FISH usado para pesquisar a sequência BCR-ABL na leucemia mieloide crônica. Essa sequência anormal é formada pela translocação de uma parte do cromossomo 22 (BCR, em verde) com uma parte do cromossomo 9 (ABL1, em vermelho). A mancha amarela (mistura de vermelho e verde) mostra o gene formado pela fusão. O achado da sequência BCR-ABL confirma o diagnóstico de leucemia mieloide crônica e permite prever a resposta ao medicamento imatinib.

Fontes
(August 16, 2010) Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000206 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(August 16, 2010) Frequently Asked Questions about Genetic Testing. National Human Genome Research Institute [On-line information].Available online at http://www.genome.gov/19516567 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(March 6, 2006) Genetics Home Reference. Fluorescent in situ hybridization. Available online at http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fluorescentinsituhybridization through http://ghr.nlm.nih.gov. Accessed March 2011.

(June 29, 2011) Hiller B, Bradtke J, Balz H and Rieder H (2004). CyDAS Online Analysis Site. Available online at http://www.cydas.org/OnlineAnalysis/ through http://www.cydas.org. Accessed July 2011.

Reação em cadeia de polimerase (PCR) é um método de produção de um grande número de cópias de trechos pequenos de DNA a partir de amostras muito pequenas de material genético. O método também é chamado “amplificação” do DNA e permite detectar e medir genes específicos.

O DNA é composto por sequências de quatro bases – adenina, timina, guanina e citosina. Estão dispostas em duas cadeias ligadas entre si por pontes de hidrogênio que formam uma hélice dupla semelhante a uma escada em espiral. Cada metade da hélice é complemento da outra. A sequência específica das bases forma o material genético de um indivíduo e é usada para produzir RNA, que, por sua, vez produz proteínas. Há cerca de 25.000 genes no genoma humano, cuja expressão orienta a produção das proteínas que formam o corpo. Todos os seres vivos, incluindo bactérias e vírus, têm estruturas análogas de DNA, com exceção de alguns vírus em que o RNA substitui o DNA.

Como o método é executado?

A PCR se constitui de diversos passos ou “ciclos” em um instrumento chamado termociclador, que aumenta e diminui a temperatura da amostra em intervalos definidos durante o procedimento.

1. O primeiro passo separa as duas cadeias de DNA aumentando a temperatura da amostra. É chamado desnaturação do DNA.

2. Depois de separadas as cadeias, a amostra é esfriada um pouco e são adicionados iniciadores (primers), que são sequências de DNA complementares do início ou do fim da área a ser amplificada.

3. Depois que os primers se ligam a cada cadeia de DNA, é adicionada uma enzima (em geral, a polimerase Taq), que acrescenta bases às duas cadeias separadas e forma duas cadeias duplas iguais à original a partir dos primers. A polimerase Taq é extraída de uma bactéria (Thermus aquaticus) encontrada em água muito quente de fontes térmicas e gêiseres. Ela é especialmente útil porque não é destruída em temperaturas altas, como a maioria das enzimas comuns.

4. O processo é repetido com as duas cadeias duplas formadas, gerando quatro cadeias novas. Assim, a cada ciclo é dobrado o número de cadeias presentes na amostra.

5. Após 30 a 40 ciclos, são produzidas bilhões de cópias do DNA original, quantidade suficiente para uso em testes diagnósticos moleculares. Todo o processo é automatizado, e dura algumas horas.

Como é usado?

Esse método pode ser usado para detectar genes no DNA de uma pessoa, como os associados a câncer ou a distúrbios hereditários, ou para detectar e quantificar material genético e bactérias ou vírus infecciosos.

Abaixo estão alguns exemplos de exames laboratoriais que usam PCR:

• JAK2 (Janus quinase 2)

• Doença de Lyme

• Bordetella pertussis

• Papillomavirus genital humano (HPV) 

• Citomagalovírus (CMV)

• Gonorreia 

• Clamídia

• Identificação de pessoas

PCR após transcrição reversa (Transcriptase reversa – PCR)

Esse método usa a PCR para amplificar o RNA viral, que é encontrado como uma cadeia única e precisa e é transcrito em DNA antes de ser amplificado. Essa transcrição é feita pela enzima transcriptase reversa e um primer. A enzima copia o RNA formando uma cadeia urina de DNA, que depois é duplicada. Esse DNA de cadeia dupla pode, então, ser amplificado por PCR. A detecção pode ser feita também em tempo real.

Dois exemplos de métodos que usam transcriptase reversa e PCR:

• Carga viral do HIV

• Hepatite C (HCV)

Fontes

(February 27, 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000207 through www.genome.gov. Accessed August 2012.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. St. Louis: Elsevier Saunders; Fifth edition, 2011, Pp 1412-1413.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Pp 135-137.